基础研究
mTOR抑制剂对癫痫大鼠免疫微环境的影响
谢扑松 何金水 周火旺
【摘要】 目的 探讨mTOR抑制剂对癫痫大鼠血液和脑组织免疫微环境的影响。方法 选用40只癫痫大鼠，随机分为4组，每组10只，空白对照组（生理盐水干预），不同剂量mTOR抑制剂（雷帕霉素）干预组：低剂量组[1 mg/（kg•d）]，中剂量组[2 mg/（kg•d）] ，高剂量组[4 mg/（kg•d）]。分别进行为期8周的干预，8周后处死大鼠，保留大鼠血清及脑组织样本。经ELISA法检测大鼠血清IL-2、IL-10和IFN-γ水平。经流式细胞技术检测大鼠脑组织的T细胞亚群。
【关键字】 癫痫,mTOR抑制剂,大鼠,免疫微环境
中图分类号：文献标识码：文章编号：
Objective To determine the influence of rapamycin intervention on epileptic rats blood and the brain tissue immune microenvironment. Methods A total of 40 epileptic rats were used in the study and randomly divided into 4 groups (n=10). The blank control group with normal saline intervention, and with different doses of rapamycin: low-dose group [1 mg/（kg•d）], medium-dose group [2 mg/（kg•d）], high-dose group [4 mg/（kg•d）]. Rats in the four groups went through intervention for 8 weeks. After 8 weeks, the rats were sacrificed, rat serum and brain tissue samples were reserved. The ELISA method was used to test peripheral blood (PB), IL-2, IFN-γ and IL-10 levels. Flow cytometry was used to test the state of T-cell subsets.
癫痫是神经系统常见疾病之一，癫痫的发作给患者造成巨大的生理和心理创伤，同时给患者带来沉重的经济负担。癫痫的发病机制目前尚未完全明确。有研究表明，癫痫的发生与胶质细胞增生、神经元凋亡、免疫炎性反应以及异常通路形成密切相关[1]。有研究证实，大脑的炎性反应和免疫损伤在癫痫发生、发展过程中起重要作用[2]。许多研究数据显示激活mTOR信号通路可在遗传性和获得性癫痫所起的重要作用[3]。mTOR作为信号级联的中央节点影响免疫微环境中各种信号的输入，调节各种免疫细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞以及APC等细胞的分化发育，并影响其功能活性[4]。雷帕霉素是一种mTOR抑制剂，可通过不同的细胞因子影响信号传导，从而阻断T细胞由分化进程，发挥免疫抑制的作用。目前，雷帕霉素干预癫痫模型探讨癫痫发病机制的研究甚少。本研究通过建立癫痫大鼠模型，用不同剂量雷帕霉素和生理盐水干预后，观察大鼠外周血和脑组织T细胞亚群以及IL-2、IFN-γ和IL-10含量的变化，探讨雷帕霉素干预对大鼠血液和脑组织免疫微环境的影响。
1 材料与方法
1.1材料 将8周龄SPF级雄性大鼠进行癫痫建模。研究选用40只建模成功的大鼠，无水氯化锂（北京索莱宝科技有限公司），盐酸毛果云香碱（阿拉丁），雷帕霉素(中国上海源叶生物科技有限公司)、IL-2、IFN-γ和IL-10试剂盒(R&D SYSTEMS)、RAT CD3、RAT CD4、RAT CD25试剂盒（BD），流式细胞仪、离心机和光学显微镜。本研究经厦门大学实验动物管理与伦理委员会批准（伦理批号XMULAC20220008）。
1.2方法 将40只癫痫大鼠随机分为4组，每组10只，空白对照组（生理盐水干预），不同剂量mTOR抑制剂（雷帕霉素）干预组：低剂量组[1 mg/（kg•d）]，中剂量组[2 mg/（kg•d）]，高剂量组[4 mg/（kg•d）]。干预8周后颈脱位处死。取全血5 mL，4 ℃离心10 min，血清保持在-20 ℃。经酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测大鼠血清IL-2、IL-10和IFN-γ。取额叶脑组织5 g，用电动匀浆器制成组织匀浆，静置、离心，取上清液保存-80 ℃冰箱备用。分离单个核细胞经RPMI-1640培养基调整，将其置于24孔板内，每孔1 mL。置于孵箱中孵育培养，将细胞悬于100 μL PBS中，加入标记的CD3、CD4和CD25抗体5 μL，室温避光反应15 min。用PBS洗涤2次，并将细胞悬于300 μL PBS内进行流式细胞术检测。
1.3 统计学分析 采用SPSS21.0软件进行统计分析。对数据进行正态性检验，满足正态分布，采用单因素ANOVA分析；不满足正态分布，采用非参数检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 ELISA实验 每组预计检测10只，共4组，但在取样前共有5只大鼠死亡。正常大鼠（未使用生理盐水或者mTOR抑制剂干预的大鼠）检测了1只。
2.1.1 IL-2检测 检测结果如表1，根据标曲y=0.0008x+0.3329（R2=0.9913）计算得到各组大鼠的IL-2含量。正常大鼠IL-2含量为-27.4 pg/mL。行正态性检验发现中剂量组不满足正态分布，采用非参数检验，P＞0.05，IL-2的表达量差异无统计学意义。